EMSA（凝胶阻滞实验）

　EMSA（凝胶阻滞实验）

　　EMSA凝胶/电泳迁移率实验技术服务常见问题

　　1、EMSA原理及方法

　　EMSA称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测，是一种用于研究转录因子和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的DNA结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。

　　EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。

　　2、看不到迁移条带

　　1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。

　　2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。

　　3）探针与蛋白无特异性的相互作用。

　　4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。

　　5）曝光或者成像时间过短。

　　6)在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：

　　a.抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。

　　b.测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。

　　c.使用的抗体过度稀释。一般10～20 ul的反应液需要使用0.5～1 ul原倍的抗体。

　　d.多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

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